E.coli prep 및 일반 PCR 실험

- DNA prep method

1) 1.5 mL tube에 Labeling

2) 1.5 mL tube에 Proteinase K ....20uL 첨가, E.coli 200uL첨가, GB buffer  200uL 첨가

3) vortexing 후, spin down, incubation 60도 10min

4) Incubationg 60 °C, 10min

5) 99% EtOH 400 uL 첨가 후 pipetting

6) Binding column을 collection Tube에 장착 후 820 uL용액 전체를 옮김

7) Centrifuge 8000rpm, 1min

8) 내려간 Solution 제거, Binding Column을 Collection Tube에 다시 장착

9) WA1 500 uL 첨가

10) Centrifuge 8000rpm, 1min

11) 내려간 Solution 제거, Binding Column을 Collection Tube에 다시 장착

12) W2 500 uL 첨가

13) Centrifuge 8000rpm, 1min

14) 내려간 Solution 제거, Binding Column을 Collection Tube에 다시 장착

15) 공회전 13000 rpm, 1min

16) Collection Tube 제거, 새로운 1.5mL Tube labeling 후, Binding Column 장착

17) EA buffer 200  uL 첨가 후 1min 반응(칼럼 가운데로 넣기)

18) Centrifuge 8000rpm, 1min

19) Binding Column 제거

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-E.coli 16s rDNA 일반 PCR
1) 1.5mL Tube에 Labeling

2) Mixture 제조

(polymerase, primer F,R, D.W)

3) 일반 PCR Tube 2개에 각각 라벨링

4) Tube에 Mixture 18 uL 첨가

5) 일반 PCR 조건 설정

 

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이후 아가로스 겔을 이용한 전기영동을 통해 정성분석을 진행한다.

 전기영동 결과, 16s E.coli는 1500bp이다.