Bovine adenovirus 정량 검출을 위한 Taqman Probe Realtime PCR

date.24.05.14

 

1. introduction

Bovine adenovirus

-가장 흔하게 감염되는 바이러스 중 하나

-소 유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BADV 안정성 확보를 위해

원료물질, 제조공정, 완제품에서 BADV를 정량적으로 검출하고 제조공정에서 BADV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능하다. 

 

Taqman probe

-5'말단은 형광물질, 3'말단은 형광억제물질로(Quencher) 수식한 Taqman Probe를 PCR 반응액에 첨가한 반응이다.

-Extension 반응 시에 Taq DNA polymerase가 갖는 5'->3' Exonulease 활성으로 template에 hybridze한 taqman probe가

분리되어 형광색소가 probe에 유리되며 억제제에 의한 억제가 해제된다.

 

 

2. materials

: Heating block, 99%EtOH, Real-time PCR mater mix, 1.5 mL tube, collection tube, Bovine adenovirus primer, pipette, Binding column, probe, Tip, centrifuge, Rox, Proteinase K, WA1, D.W, Bovine adenovirus, W2, Fast reaction tube, GB buffer, optical 8-cap strip

 

3. Methode

1) DNA prep

2) BADV TaqMan Probe Real-time PCR

3) Mixture 제조

 

4. Result

5. Discussion

이번실험은 TaqMan Probe 를 사용하여 RealTime PCR을 진행하였고, Bovine adenovirus의 정량 검출을 위해 실시간 증폭을 확인하는 실험이다. 실험결과에 Ct값이 원액에서 대략 3씩 증가하는 모습을 보이고 NC값이 검출되지 않았다. NC에는 바이러스 대신 D.W를 첨가하였으므로 잘 나온 결과이다. 또한, 결과의 standard curve 를 확인해 보면 R^2값이 0.993인것을 확인할 수 있다. R^2값은 최소 0.99이상, 1에 가까울 수록 실험결과는 믿을 수 있다 판단하기 떄문에 R^2값도 잘 나온것을 알 수 있다. slope 값은 -3.2이다. slope 값을 이용하여 PCR의 효율을 알 수 있는데, 이상적인 값은 -3.3~-3.8이다.(PCR효율 100%) 실험결과는 이에 못미치는 -3.2이므로 효율이 약간 낮은 것을 알 수 있다. 

이를 최소화하기 위해 오염가능성 있는 요인을 최소화 하여 실험을 진행한다.