pull down assay 원리

오늘은 정제공정 과목에서 배운 pull down assay에 대해 소개하려 한다.

먼저, pull down assay는 단백질-단백질 간의 interaction을 확인하는 실험 방법이다.

다른 단백질 정제 시에 사용하는 방법이다

-methode

1. "bait"단백질에 GST-tag을 부착한다.

2. tag에 특이적으로 결합하는 bead를 넣어 침전시킨다.

(bead가 무겁기 때문에 가라앉는다.)

3. wahing(tag에 결합 못한 bead 제거)

4. "prey" 단백질을 넣어준다.

5. 두 단백질이 상호작용한다.(결합)

6. washing(결합 못한 단백질 제거)

7. 전기영동을 통해 관찰한다.

* 이때 sonication을 이용하여 박테리아를 lysate 시킨다.

이후 elution 시킬때는 과량의 글루타치온을 넣어 구조를 유지하며 elution시킬 수 있고

다른 방법으로는 boling하여 구조 유지없이 elution 시킨다.

-논문 해석

예를 들어 이러한 전기영동 결과가 나왔다 생각해보자

실제 논문의 data이다.

위 실험에서 Na3VO4는 vandate로 인산의 아날로그이다.

따라서 위 실험은 pull down assay를 통하여 V5-PTPRK와 ZNRF3-HA의 상호작용을 알아보고,

그 상호작용이 어떤 결합인지 알아보는 실험이다.

vanadate가 존재할 때, bead에 부착한 ZNRF3-HA 단백질은 감소하고(band 감소)

elution 시 양이 많아지므로 둘의 결합은 인산기 결합임을 알 수 있다.

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