Cloning (1)-전체 과정

-방법

A. EGFR의 mRNA를 cDNA로 역전사 효소를 이용하여 역전사 시킨다.

(RNA가 변성이 잘되기 때문에 비교적 안정한 DNA를 사용한다.) 

B. 역전사 시킨 cDNA를 증폭하기 위해 PCR을 진행한다.

  B-1) DNA이중가닥을 풀기 위해 95도의 열을 가해 변성시킨다.

  B-2) 약간 냉각시킨 후 45-60도에서 프라이머를 부착한다.

  B-3) 72도에서 Taq중합효소가 주형가닥에 상보적인 서열로 확장하고 DNA를 형성한다.

C.  전기영동을 통해 PCR이 잘 되었나 확인한다.

D. 제한효소를 이용해 vector에 증폭한 DNA를 넣어준다.

  D-1) 단백질들은 우리가 원하는 제한효소를 갖고 있지 않아서 프라이머 양끝에 제한효소 인식 부위를 넣어주고 PCR 처리한다.  

      따라서 양 끝에 제한효소 처리가 가능한 DNA가 형성된다. 

E. Vector에 DNA기 잘  Transformation(형질전환) 되었는지 확인한다.

  E-1) 형질전환 vector를 E.coil에 넣는다.

  E-2) 형질전환을 확인하는 방법으로는 blue/white screening, colony PCR, sanger sequencing 등이 있다.

 

*PCR 과정에서 필요한 것

1. DNA sample

2. Primer

3. Nucleotide

4. Taq polymerase

5. Mix buffer

6. Pcr tube

 

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Result. 프라이머 디자인

1. Sense

: 5'-CATGG(random sq) GAATTC(제한효소 자리) ATGGTGACAAGGGC-3'

 

2. Anti-sense

:5'-GCATT(random sq) GGATCC(제한효소 자리) AATGAACATGTCGAG-3'

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Discussion

PFU DNA polymerase vs Taq DNA polymerase

: Taq 중합효소는 5'->3' 활동은 뛰어나지만, proofreading 과정이 없어서 오류가 축적될 수 있다. 

Pfu 중합효소는 느리지만 proofreading 과정을 가지므로 높은 정확성을 갖는다.