PCR primer design하기

PCR을 배우게 되면 가장 먼저 하는게 

내가 원하는 바이러스에 대한 primer를 디자인하는 것이다. 

 

손으로 직접 하는 방법도 있지만 프로그램을 이용하면

훨씬 간단하게 알아낼 수 있다. 

오늘은 그 방법을 소개하고자 한다.

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1.

먼저, target 바이러스를 NCBI에 들어가서 검색해준다.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

National Center for Biotechnology Information

검색창에 내가 원하는 바이러스 이름+complete genome으로 검색해준다. 

EX)

예를 들어 porcine parvovirus 바이러스에 대해 pcr을 하자

그러면 검색에 porcine parvovirus complete genome을 검색한다.

이런 화면을 찾을 수 있는데 여기서 Genomes - Nucleotide에 들어가서

Porcine parvovirus, complete genome 이라 적힌 (isolate X) 6번을 클릭해보면

원하는 바이러스의 origin 전체를 볼 수 있다. 

 

2. 

 

이렇게 바이러스의 정보를 확인할 수 있는데,

바이러스 이름 및에 적힌 NCBI number도 확인할 수 있다.

NCBI reference sequence: NC_001718.1

 

3. 

다음으로 primer를 디자인 할 건데, 

CDS를 선정할 때, /product가 non-structure P인 것을 선택한다. 

non-structure가 변이가 적어서 선정한다고 한다.

원하는 cds를 선정하고 클릭하면 아래 서열로 이동된다.

4.

구글에 primer 3을 검색하면

primer3 input이라는 사이트가 나온다.

https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/

Primer3 Input (version 0.4.0)

사이트에 들어가서 갈색부위가 온전한 부위

사진에서는 301번부터 복사해서 붙여넣는다.

가운데 있는 pick hydridization probe도 켜준다.

사진 가장 아래 있는 product size ranges를 150-250으로 수정해준다. 

(서열이 5줄 이상이어야 한다.)

다음으로 pick primer 버튼을 눌러준다.

 

5. 

그러면 이런 화면으로 넘어오게 된다.

Left primer = forward primer

Right primer = reverse primer이다.

primer의 sq 확인 가능하다.

L.P:

atgcatcattggggaaatgt

R.P:

gcaggttggtgaaagttggt

Amplicon size는 product size에서 확인 가능하다. (220개)

Nucleotide position은 301번부터 복붙했는데 사이트 내에서 301번이 1번으로 바뀜

-> 앞에 300개의 n.t가 생략됨

따라서 start에 +300을 해준 값으로 생각하면 된다.

 

EX)

left primer start : 1639

Nucleotide position: (1939~1959)가 된다. 

-> len이 20개라서

 

각 primer의 Tm값도 확인할 수 있다.

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다음으로 qPCR에서 사용하는 TaqMan probe를 확인하고자 한다. 

primer3에서 켜줬던  pick hydridization probe가 probe를 디자인 해주기 위함이었다. 

probe의 sq은

caactacgcagcaactccaa

Nucleotide position도 다른 primer와 동일하게 +300을 해준 값으로 계산한다.

EX)

Nucleotide position: (2064~2083)임을 알 수 있다.