sprouting assay 실험 기록

주로 암 치료제의 효능을 평가할 때, 사용하는 실험 방법으로

신생 혈관의 정량이나 성장을 확인할 수 있다.

림프내피세포를 이용하여 실험한다.

구체적인 실험방법은 키우는 세포와 목표하는 결과에 따라 다르겠지만

내가 해본 실험 방법을 기록하고자 한다.

-method

*실험 전 처리

실험 시작 전 mc bead를 수화시켜놓아야 한다.

1. mc bead powder를 정량하고 pbs를 농도에 맞게 넣고 4시간 수화시킨다.

2. Autoclave

3. 10분씩 2번 침전시켜 상등액과 mc bead를 분리하고 상등액을 제거한다.

4. EBM(LEC 배지)를 농도에 맞게 넣고 냉장보관한다.

5. 실험 시작 전에 30분간 rt에 둔다.

*Day 1(cell 용량, mc 용량, EBM용량 미리 결정)

1. 비점착식 24well에 LEC cell을 넣는다.(cell 개수 counting 후 원하는 cell 만큼)

2. 미리 만들어 놓은 mc bead를 용량에 맞게 넣는다.

3. 30분동안 rt에서 rocking진행

4. 30분동안 37도 인큐베이터에서 배양

5. 2분 rt에서 rocking 진행

6. 30분 인큐베이터, 2분 rocking을 4번 반복한다.

7. EBM 배지를 넣고 48시간 배양한다. (37도)

*Day 2(after 48H)

1. 24well에서 코니칼 튜브로 옮기고 2.5mL 배지로 resuspension 진행

2. cell tracker green을 넣는다.

3. washing 진행하고 콜라겐 mix를 넣는다.

4. 96well plate에 80uL씩 나누어 넣는다.

5. 1시간 인큐베이션하여 콜라겐 gel이 굳도록 한다.

* 약물처리

1:1000희석하여 약물 처리하고 PFA를 통해 cell을 고정시킨다.

24시간 배양 후 관찰한다.

나의 작은 텃밭