전공 활동/실험22 3. 배지 갈아주기(세포배양) 계대배양 중간중간 영양분이 떨어지지 않게 배지를 갈아줘야 한다. -방법1. 배지 석션2. Pbs washing3. Pbs 석션4. 배지 7-8ml 넣기5. 인큐베이터에 넣기계대배양과 다른 점은 트립신을 넣지 않는 것이다.트립신은 부착형 세포를 부유하게 만들어주기 때문에 배지 교체 시에 굳이 사용할 필요가 없다.FBS는 트립신을 억제하는 작용을 하기 때문에 트립신 처리 후 FBS 사용해서 트립신의 작용을 멈춘다. 2023. 12. 17. 2. 배지 만들기 (D10 배지) -배지 구성: DMEM, FBS, P/s(DMEM, FBS: 세포에게 영양 공급 / p/s: 배지 오염 예방) -방법1. 50ml 코니칼 튜브에 DMEM 45ml 넣어준다. 2. 5ml FBS를 넣어주고 잘 섞어준다. 3. P/s 500ul 넣어주고 잘 섞어준다. (걸쭉하므로 잘 섞어야 한다.)4. 새로운 코니칼 튜브에 라벨링 한다. (배지 이름, 날짜, 만든 사람)5. 시린지 필터를 새로운 튜브에 얹고 주사기를 꽂는다.6. 주사기에 만든 배지를 넣고 내려준다. (중간에 멈추면 공기가 유입돼서 나오지 않으므로 한 번에 내려야 한다.)7. 뚜껑을 꽉 닫고 파라필름으로 잘 감싸준다. 모든 실험은 무균조작대에서 진행한다. 2023. 12. 17. 1. 세포 계대배양 -method1. 배지를 석션한다.2. Pbs로 세포에 남아있는 FBS 성분을 washing 하고 석션한다. (2ml)3. 10cm dish 기준 트립신 3ml 넣어주고 인큐베이터 37도 3분 처리한다.4. 인큐베이터 돌린 디쉬에 트립신과 1:1 비율로 배지를 넣어준다. (배지 3ml)5. 에이드를 이용해서 15ml 코니칼 튜브에 옮겨 담는다.6. Pbs를 이용해서 디쉬에 남아있는 세포들을 washing하고 튜브에 옮긴다.7. 원심분리 1060rpm, 3M, 4도 설정8. 팔렛만 남겨두고 상등액은 석션한다. 9. 배지 1ml로 팔렛을 잘 풀어준다. (Up & down)10. Dish에 배지 7ml를 넣고 팔렛 250ul 넣어준다. (1:4 계대배양 기준)11. 잘 섞어주기 위해 디쉬를 8자로 흔든다... 2023. 12. 17. Cloning (1)-전체 과정 -방법 A. EGFR의 mRNA를 cDNA로 역전사 효소를 이용하여 역전사 시킨다. (RNA가 변성이 잘되기 때문에 비교적 안정한 DNA를 사용한다.) B. 역전사 시킨 cDNA를 증폭하기 위해 PCR을 진행한다. B-1) DNA이중가닥을 풀기 위해 95도의 열을 가해 변성시킨다. B-2) 약간 냉각시킨 후 45-60도에서 프라이머를 부착한다. B-3) 72도에서 Taq중합효소가 주형가닥에 상보적인 서열로 확장하고 DNA를 형성한다. C. 전기영동을 통해 PCR이 잘 되었나 확인한다. D. 제한효소를 이용해 vector에 증폭한 DNA를 넣어준다. D-1) 단백질들은 우리가 원하는 제한효소를 갖고 있지 않아서 프라이머 양끝에 제한효소 인식 부위를 넣어주고 PCR 처리한다. 따라서 양 끝에 제한효소 처리가.. 2023. 12. 17. 6. phage titration protocol -introduction : 특정 용해물에서 plaque 형성 단위 PFU의 밀도를 정량화한다. 재고 현탁액에서 실행가능한 파지입자의 수를 결정한다. -methode a. 3mL soft LB agar(l)와 살모넬라(LT-2) 100 μL를 voltexing 한다. b. a용액을 LB plate에 넣고 알코올램프 근처에서 굳힌다. c. phage (p22) 원액을 희석한다. (10^-1~10^-8까지 진행한다.) =1.5 mL tube에 90 μL LB와 10 μL phage를 넣고 up and down 2번 진행 d. plate labeling 한다. e. 왼쪽부터 10^-6, 10^-7, 10^-8 10 μL 씩 접종한다. f. 37도 인큐베이터에서 배양하고 plaque 관찰한다. -Result P.. 2023. 11. 21. 5. phage transduction -introduction : phage는 카나마이신(항생제) 저항성을 갖고 있고 살모넬라는 항생제 내성이 없다. 따라서 Km배지에는 살모넬라는 자랄 수 없고 phage가 transduction 된 살모넬라만 성장할 수 있다. -방법 a. 37도 O/N배양한 살모넬라 전 배양액을 사용한다. b. tube에 LT-2(살모넬라) 200 ml와 phage(50 μL)를 넣고 tapping 한다. c. 상온에 10분 방치(=rt 10분) d. 카나마이신 배지에 1000 μL LT-2 spreading 한다. (CTL) e. LB배지에 1000 μL LT-2 spreading 한다. (CTL) f. 카나마이신 배지에 b용액을 100 μL spreading한다. g. spreading전에 배지에 labeling 한다.. 2023. 10. 31. 이전 1 2 3 4 다음
